摘要 ?合成材料組織工程骨移植物是當前骨移植材料研發重點，發展迅速，但是，目前研發的各類支架材料性能存在缺陷，還不能完全滿足臨床要求；細胞體外篩選、擴增、分化和為能在局部持續釋放細胞因子而采用的轉基因細胞移植或腺病毒轉染局部細胞等技術還存在安全隱患，回植體內后不能保證細胞活性，細胞骨組織工程種植體構建質量、及時性，儲存、運輸等方面還不具臨床規模化應用的可行性。目前，無細胞人工合成材料在臨床上脊柱融合、良性骨腫瘤刮除后填充等方面應用較普遍，細胞骨組織工程移植物應用僅見于散在病例報道。
關鍵詞 ?骨組織工程；支架；干細胞；細胞因子；
臨床上嚴重創傷、腫瘤切除、骨感染、骨壞死等原因導致的的骨缺損、骨折不愈合以及人工假體置換及翻修、脊柱、關節融合等十分常見，自體皮質-松質骨移植仍是無法被替代的“金標準”，但是，存在諸如供區新的創傷、感染、疼痛等并發癥，特別是，來源有限不能滿足臨床需要，因此，同種異體骨以較好的骨傳導、誘導性，成為繼自體骨移植之后的首選[1]，但是，來源仍然有限，其他缺陷如：新鮮異體移植存在疾病傳播、免疫排斥和難以保存等問題；深低溫或凍干處理可降低免疫原性和疾病傳染，但成骨誘導性能降低；異體脫鈣骨（demineralized bone matrix ，DBM)的骨誘導性也較差，并受加工方法和供體年齡等因素的影響等。在自體和異體骨越來越不能滿足臨床需要的的情況下，組織工程化骨人工合成材料的研發與應用成為重點。
1. 組織工程化骨修復材料的臨床應用現狀 ?器官的組織工程的一般技術路線是在體外用支架、種子細胞、細胞活性因子有機結合，構建有生命的種植體，植入缺損部位，以替代病損組織器官，恢復正常的生理結構和功能。骨組織結構、生化代謝和生理功能相對較簡單，與軟骨、肌腱、神經等組織工程再造相比，骨組織工程又具有一定的特殊性，其種植體的構建除經典的支架+細胞+細胞活性因子模式外，還有支架+細胞和支架+細胞活性因子等。從1965年Urist發現骨形態發生蛋白質（Bone Morphogenetic Protein,BMP），40年來研究者著力構建了承載BMP的緩釋系統（Drug Delivery ? 作者單位： 200025 上海交通大學醫學院瑞金醫院骨科上海市傷骨科研究所 ?基金項目： ? 上海市“登山計劃”，No.06DZ220202 System,DDS），這種支架+細胞活性因子植入體內后，局部持續釋放BMP，作用于隨血管和肉芽長入的基質干細胞和血液中骨髓干細胞，誘導成骨促進骨修復。學者將這種無細胞種植體歸為廣義組織工程骨范疇，而且后者省掉了細胞分離培養、復合等復雜環節，不涉及細胞移植的倫理學問題，生產、保存、運輸方便，更貼近臨床規模化應用，成為骨組織工程的重要補充。 ? ? ? 無細胞人工材料普遍用于良性骨瘤刮除后填充和脊柱融合等 [2、3] ；細胞型組織工程骨 在2001年后陸續應用于臨床。Vacanti用羥基磷灰石支架（hydroxyapatite scaffolds，HAS）復合經過體外擴增的骨膜細胞后，立即植入體內修復再造外傷性缺失的拇指遠節指骨[4]，證明了此方法臨床有效性；Quarto等[5]體外培養擴增自體骨髓基質干細胞（bone mesenchymal stem cells ，BMSCs)，與HAS復合構建細胞+支架移植物，立刻植入4-8cm骨干缺損處，證明對大骨缺修復有促進作用，7年隨訪效果滿意；柴崗等[6]等用自體BMSCs復合DBM修復頜面部骨缺損成功；楊志明等[7]用異體骨膜復合支架修復多部位骨缺損、骨不連取得良好效果；Warnke等[8、9]利用鈦合金網填充牛骨松質顆粒，復合自體BMSCs、BMP-7和Ⅰ型膠原（collagen type-Ⅰ）后立刻植入背闊肌袋中使血管化，7W后二次移植到下頜骨缺損處，成功再造下頜骨；Kitoh等[10]報道在用牽張成骨方法來治療2例軟骨發育不良、1例先天性脛骨假關節遺留下肢不等長（3個股骨、2個脛骨）時，在局部注射經體外擴增和誘導向成骨樣細胞分化的自體BMSCs、混入凝血酶（thrombin）、鈣離子(calcium)的富含血小板的血漿（platelet-rich plasma ，PRP) ，可加快成骨并安全微創；Morishita等[11]將自體BMSCs體外擴增、成骨誘導，在2-4d分化為成纖維細胞是與HA復合，經過4W增殖分化，通過檢測證明成骨構建了體外再生骨，并用于3例良性骨腫瘤治療，術后影像學結果顯示，骨修復速度比文獻報道的單純HA明顯加快。.此外，組織工程技術在口腔頜面外科重建腭骨[12]牙周組織[7] 牙槽骨裂成型 [13] ，以及上頜竇底加強 [14] 、牙槽骨脊重建 [15] 等都有報道。迄今， 臨床應用只是一些零星報道和初步觀測，對該技術臨床全面評價尚缺乏足夠的資料[16]
2． 規模化臨床應用面臨的主要問題和對策 ?
2.1 ?目前制約骨組織工程臨床規模化應用的是基礎研究的各個環節存在的技術瓶頸。 ? ? 首先，目前開發的單一支架材料各有優缺點，如天然膠原和纖維蛋白凝膠組織相容性較好，但機械性能差；可降解是聚乳酸等人工材料優點，但親水性及組織相容性差；以磷酸為基礎的骨水泥、陶瓷或生物活性玻璃等材料的生物相容性及骨傳導性較好，但力學性能差、易碎裂而不能滿足臨床要求。復合材料性能一定程度上可產生優勢互補，但距臨床要求存在差距。目前臨床應用的主要是羥基磷灰石。其次，細胞選擇、培養等環節存在安全隱患。自體BMSCs的應用最貼近臨床，但干細胞在骨髓中含量極低（0..003—0.015%） [17] ,必須先獲 取并在體外擴增，然而，研究表明最大24-40次倍增就會進入老化或生長停滯期，從而限制了臨床應用[18]。基因工程方法異位表達端粒酶反轉錄酶，可以消除因多次細胞分裂引起染色體端粒的縮短，細胞可無限分裂，從而無限延長細胞壽命 [19] ，但出于安全考慮只限于實 驗室。干細胞從體內到體外，細胞會出現行為變異與轉型[20]，體外擴增細胞輸入體內后也會異常生長 [21] ，一項研究顯示鼠類的骨髓基質干細胞經過體外長期培養后導致染色體積累 損傷，最后出現惡變[22]；細胞體外培養常規在培養液中加胎牛血清，不可避免會傳染疾病如瘋牛病[23]或由異體蛋白觸發免疫反應[24]。此外，也有研究者立足自體成體細胞，利用轉基因技術，將4種基因[25]OCT4、NANOG、SOX2、LIN28或OCT3/4、SOX2、C-MYC和KLF4 [26] 轉入到人的體細胞中，得到類似于胚胎干細胞的多能干細胞，增強增殖分化能力， 滿足治療需要，但潛在致瘤風險只限于實驗室。自體來源的種子細胞不能用來儲備建細胞庫，急需時方可著手準備，體外擴增時間長，患者不得不長時間等待。同種異體細胞可作為細胞庫種子細胞預先儲備，但是，除了遇到與自體細胞相同培養問題外，涉及更為復雜的免疫原性問題。研究發現基質干細胞具有免疫調節作用[27]，包括促進I型輔助T細胞向Ⅱ型轉變、下調NK細胞釋放干擾素--γ(IFN-γ)、和B細胞合成抗體，并且，為避免牛血清培養帶來風險，用人冰凍血漿 [28] 或血小板裂解液 [29] 代替牛血清，發現不僅可提高增值率，而且不改變 形態學、免疫表型和分化能力,也沒有基因異常[30、31]、并且保持了免疫修飾，抑制異體蛋白導致淋巴細胞增殖[32]，對裸鼠不具致瘤性[33]，這為用異體基質干細胞作為種子細胞建庫提供支持；另外，研究發現CTLA4-Ig（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen4-Ig）是一種融合免疫球蛋白，可以選擇性地阻斷CD28與B7的信號傳導通路，阻斷T細胞殺傷作用和產生免疫耐受。將CTLA4-Ig基因轉到異體MSCs，改變移植細胞的性狀，逃避或阻止宿主識別，降低異體細胞免疫原性，以此構建組織工程骨成功實現了異位成骨 [34] ；除了干細胞 外，有研究證明胎兒骨細胞在免疫原性和成骨性能上優于骨髓干細胞[35]，少量來源就可滿足種子細胞建庫需要；以上發現有待于長期觀測論證。第三，目前構建的緩釋系統對成骨因子緩釋不能完全模擬體內過程。常用的一些基因技術手段如轉基因細胞移植或腺病毒轉染局部細胞在局部生產細胞因子，有導致免疫反應、傳染疾病、細胞惡變之嫌[22、23、24、35]。 。第四，種植體在體內外構建過程中細胞生存狀態不確定，因為，細胞生存要求穩定外環境，包括溫度、PH值和營養和氧氣供應 [37] ，體內細胞和毛細血管距離20-200μm，細胞通過彌散 獲取營養和氧氣[38]，在體外，100-200μm距離也可實現[39],細胞在體外三維結構中，營養和氧氣獲取困難，復合細胞的結構質量逐漸下降[40、41、42、43]；在靜態培養條件下發現三維支架